rpmjResearch'n Practical Medicine JournalResearch and Practical Medicine Journal2410-1893"QUASAR", LLC10.17709/2409-2231-2020-7-1-2rpmj-496Research ArticleОригинальные статьи. Онкология, лучевая терапияOriginal Articles. ОncologyОсобенности экспрессии иммуногистохимических маркеров при локальном и генерализованном светлоклеточном раке почкиFeatures of expression of immunohistochemical markers in local and generalized clear cell kidney cancerhttps://orcid.org/0000-0003-3618-6890ФранциянцЕ. М.FrantsiyantsE. M.

Франциянц Елена Михайловна – д.б.н., профессор, заместитель генерального директора по науке, руководитель лаборатории «Изучение патогенеза злокачественных опухолей» 

SPIN: 9427-9928

Elena M. Frantsiyants – Dr. Sci. (Biol.), professor, deputy director general for science, head of laboratory for the study of the pathogenesis of malignant tumors 

SPIN: 9427-9928

https://orcid.org/0000-0002-9468-134XШевченкоА. Н.ShevchenkoA. N.

Шевченко Алексей Николаевич – д.м.н., профессор, заведующий отделением онкоурологии 

SPIN: 2748-2638

Aleksei N. Shevchenko – Dr. Sci. (Med.), professor, head of the department of oncourology 

SPIN: 2748-2638

ДженковаЕ. А.DzhenkovaE. A.

Дженкова Елена Алексеевна – д.б.н., доцент, ученый секретарь 

SPIN: 6206-6222

Elena A. Dzhenkova – Dr. Sci. (Biol.), associate professor, scientific secretary 

SPIN: 6206-6222

КарнауховН. С.KarnaukhovN. S.

Карнаухов Николай Сергеевич – к.м.н., заведующий патологоанатомического отделения 

SPIN: 3100-0820

Nikolai S. Karnaukhov – Cand. Sci. (Med.), head of the pathology department 

SPIN: 3100-0820

ГудцковаТ. Н.GudtskovaT. A.

Гудцкова Татьяна Александровна – научный сотрудник патологоанатомического отделения

Tatyana A. Gudtskova – research fellow of the pathology department

https://orcid.org/0000-0003-0252-8725БреусА. А.BreusA. A.

Бреус Анна Алекснадровна – соискатель 

Адрес: 344037, г. Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, д. 63

Anna A. Breus – applicant 

Address: 63 14 line, Rostov-on-Don 344037

annabreus999@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7904-4414ФилатоваЕ В.FilatovaE. V.

Филатова Елена Валерьевна – к.м.н., старший научный сотрудник отделения онкоурологии 

SPIN: 7517-1549

Elena V. Filatova – Cand. Sci. (Med.), senior researcher of the department of oncourology

ШвыревД. А.ShvyrevD. A.

Швырев Дмитрий Александрович – к.м.н., научный сотрудник отделения онкоурологии 

SPIN: 7496-4043

Dmitrii A. Shvyrev – Cand. Sci. (Med.), researcher of the department of oncourology

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияNational Medical Research Centre fоr OncologyRussian Federation202012032020711624Copyright © Франциянц Е.М., Шевченко А.Н., Дженкова Е.А., Карнаухов Н.С., Гудцкова Т.Н., Бреус А.А., Филатова Е.В., Швырев Д.А., 20202020Франциянц Е.М., Шевченко А.Н., Дженкова Е.А., Карнаухов Н.С., Гудцкова Т.Н., Бреус А.А., Филатова Е.В., Швырев Д.А.Frantsiyants E.M., Shevchenko A.N., Dzhenkova E.A., Karnaukhov N.S., Gudtskova T.A., Breus A.A., Filatova E.V., Shvyrev D.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.rpmj.ru/rpmj/article/view/496Цель исследования

Цель исследования. Провести сравнительный анализ экспрессии следующих маркеров: Ki‑67, циклин D1, Е‑кадгерин, CD44, MMP‑9, VEGF, P53, виментин в опухолевой ткани почки при светлоклеточном раке в зависимости от распространенности опухолевого процесса.

Материалы и методы

Материалы и методы. Материалом для исследования послужил операционный материал 100 больных светлоклеточным раком почки, находившихся на лечении в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» МЗ РФ с 2015 по 2018 г. У 50 пациентов диагностирован локальный рак (Т1–3 а N0 М0 ), у 50 – генерализованный (Т1–4N0 М1 ). Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования материал фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч и заключали в парафин. Депарафинизацию и восстановление антигенной активности материала проводили в РТ-модуле (Thermo Fisher Scientific) с использованием Трис-буфера pH=9, в течение 20 мин при 98 °C. Постановку ИГХ-реакции проводили в иммуногистостейнере Autostainer 480S (Thermo Fisher Scientific). Применяли систему детекции UltraVision Quanto Detection System (Thermo Fisher Scientific), хромоген – DAB. Использованные антитела: E‑кадгерин (EP700Y) Cell Marque, 1:100; CD 44 (EPR1013Y) Cell Marque 1:150; Ki‑67 (SP6) Spring Bio, 1:200; P53 (DO‑7) Cell Marque, 1:200; циклин D1 (EP12) Dako, 1:200; VEGF Thermo Fisher, 1:100; Vimentin (V9) Dako, 1:150; MMP‑9 (EP100902) Epitomics, 1:100. Результаты реакций с маркерами оценивали, подсчитывая количество окрашенных клеток в каждом 3‑м поле зрения всего препарата при увеличении объектива ×200 в микроскопе AXIO Scope.A1 (Carl Zeiss). Полученные результаты выражали в процентах – доля окрашенных клеток по отношению ко всем клеткам опухоли в поле зрения. Для статистической обработки результатов использовали параметрические методы статистики. Достоверность разницы между двумя средними определяли по значению t‑критерия Стьюдента для несвязанных совокупностей.

Результаты

Результаты. При светлоклеточном раке почки в целом отмечался невысокий уровень пролиферативной активности, однако при генерализованном, по сравнению с локальным (8±0,5% и 5±0,6% соответственно), он достоверно выше (Р<0,05) также при генерализованном раке наблюдалась гиперэкспрессия циклина D1–70±3,9%, против 14,4±2,3% при локальных стадиях, Р<0,05. При генерализованном раке почки по сравнению с локальным более выражены процессы эпителиально-мезенхимальной трансформации (достоверное усиление экспрессии виментина на 28% и CD44 на 16,6% (Р<0,05), снижение экспрессии Е‑кадгерина на 24% (Р<0,05), а также активация процессов неоангиогенеза (достоверное повышение уровня экспрессии VEGF на 32%, (Р<0,05)). Белок Р53 отсутствовал в клетках локального рака почки и был крайне низким при генерализованном – 3,8±0,7%. Один из основных маркеров деградации внеклеточного матрикса MMP‑9 был примерно на одинаковом уровне при обеих стадиях: при локальном – 50±6% и 49,6±7,2% при генерализованном, разница показателей недостоверна (Р<0,05).

Заключение

Заключение. Прогрессия светлоклеточного рака почки от локальной формы к генерализованной сопровождается гиперэкспрессией циклина D1, снижением экспрессии Е-кадгерина при одновременном увеличении экспрессии виментина (нарастание признаков эпителиально-мезенхимальной трансформации), повышением экспрессии CD44 и VEGF.

Purpose of the study

Purpose of the study. To conduct a comparative analysis of the expression of the following markers: Ki‑67, cyclin D1, E‑cadherin, CD44, MMP‑9, VEGF, P53, vimentin in renal tumor tissue in clear cell kidney cancer depending on the prevalence of the tumor process.

Materials and methods

Materials and methods. The material for the study was the operating material of 100 patients with light cell kidney cancer who were treated at the National Medical Reseaгch Centгe fог Oncology of the Russian Federation Health Ministry from 2015 to 2018. 50 patients were diagnosed with local cancer (T1–3an0m0), 50 – generalized cancer (T1–4N0M1). For the immunohistochemical (IHC) study, the material was fixed in 10% neutral formalin for 24 hours and encased in paraffin. Dewaxing and restoration of antigenic activity of the material was carried out in the RT module (Thermo Fisher Scientific) using Tris buffer pH=9, for 20 minutes at 98 °C. the Formulation of the IGC reaction was carried out in the immunohistostainer «Autostainer 480S» (Thermo Fisher Scientific). Used system detection UltraVision Quanto Detection System (Thermo Fisher Scientific), and the Chromogen DAB. Antibodies used: E‑cadherin (EP700Y) Cell Marque, 1: 100; CD 44 (EPR1013Y) Cell Marque 1:150; Ki‑67 (SP6) Spring Bio, 1:200; P53 (DO‑7) Cell Marque, 1:200; cyclin D1 (EP12) Dako, 1:200; VEGF Termo Fisher, 1:100; Vimentin (V9) Dako, 1:150; MMP‑9 (EP100902) Epitomics, 1:100. The results of the reactions with markers were evaluated by counting the number of colored cells in each 3rd field of view of the entire drug at magnification of the X200 lens in the AXIO Scope microscope. A1 (Carl Zeiss). The results were expressed as a percentage-the proportion of stained cells in relation to all tumor cells in the field of vision. Parametric methods of statistics were used for statistical processing of the results. The reliability of the difference between the two averages was determined by the student's t‑test for unrelated populations.

Results

Results. In clear cell kidney cancer, a low level of proliferative activity was observed in General, but in generalized, compared with local, it was significantly higher (P<0.05) (8±0.5% and 5±0.6%, respectively), and in generalized cancer, there was an overexpression of Cyclin D1–70±3.9%, compared to 14.4±2.3% in local stages, P<0.05. In generalized kidney cancer, epithelial-mesenchymal transformation processes are more pronounced in comparison with local cancer (a significant increase in Vimentin expression by 28% and CD44 by 16.6% (P<0.05), a decrease in E‑cadherin expression by 24% (P<0.05), and activation of neoangiogenesis processes (a significant increase in VEGF expression by 32%, P<0.05). The P53 protein was absent in local kidney cancer cells and was extremely low when generalized – 3.8±0.7%. One of the main markers of extracellular matrix degradation MMP‑9 was approximately at the same level at both stages: at local‑50±6% and 49.6±7.2% at generalized, the difference in indicators is not reliable (P<0.05).

Conclusion

Conclusion. Progression of clear cell kidney cancer from local to generalized forms is accompanied by hyperexpression of cyclin D1, a decreased e‑cadherin expression while increasing vimentin expression (increasing signs of epithelial-mesenchymal transformation), an increase in CD44 and VEGF expression.

светлоклеточный рак почкилокальныйгенерализованныйKi-67циклин D1виментинCD44Е-кадгеринVEGFMMP-9P53light Cell kidney cancerlocalgeneralizedKi-67cyclin D1VimentinCD44E-cadherinVEGFMMP-9P53Работа проведена при поддержке федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.This work was supported by the Federal State Budgetary Institution «National Medical Research Centre fоr Oncology» of the Ministry of Health of the Russian Federation.ReferencesВащенко Л.Н., Карнаухов Н.С., Гудцкова Т.Н., Кварчия М.В. Сопоставление уровня экспрессии маркеров пролиферации Ki 67 и циклина D1 в тройном негативном раке молочной железы с различным андрогеновым статусом. Современные проблемы науки и образования. 2018;(4):146.Vashchenko LN, Karnaukhov NS, Gudtskova TN, Kvarchiya MV. Comparison of the level of expression of markers of proliferation Ki 67 and cycline D1 in the tripl negative breast cancer with a different androgen status. Modern Problems of Science and Education. 2018;(4):146. (In Russian).Глушанкова Н.А., Житняк И.Ю., Рубцова С.Н. Роль эпителиально-мезенхимального перехода в опухолевой прогрессии. Биохимия. 2018; 83(12):1802–1811. https://doi.org/10.1134/ S0320972518120059Glushankova NA, Zhitnyak IYu, Rubtsova SN. Role of epithelial-mesenchymal transition in tumor progression. Biochemistry. 2018; 83(12):1802–1811. (In Russian). https://doi. org/10.1134/S0320972518120059Basakran NS. CD44 as a potential diagnostic tumor marker. Saudi Med J. 2015 Mar; 36(3):273–279. https://doi. org/10.15537/smj.2015.3.9622Basakran NS. CD44 as a potential diagnostic tumor marker. Saudi Med J. 2015 Mar; 36(3):273–279. https://doi. org/10.15537/smj.2015.3.9622Pestell RG. New roles of cyclin D1. Am J Pathol. 2013 Jul; 183(1):3–9.Pestell RG. New roles of cyclin D1. Am J Pathol. 2013 Jul; 183(1):3–9.Кит О.И., Франциянц Е.М., Шевченко А.Н., Бреус А.А., Погорелова Ю.А., Нескубина И.В. Уровень некоторых факторов роста семейства VEGF при светлоклеточном раке почки. Известия высших учебных заведений северо-кавказский регион серия: естественные науки. 2018; 1(197):124–129.Kit OI, Frantsiyants EM, Shevchenko AN, Breus AA, Pogorelova YuA, Neskubina IV. Levels of some VEGF family members in clear cell renal cell carcinoma. University News North-Caucasian Region. Natural sciences series. 2018; 1(197):124–129. (In Russian).Lin J, Ding D. The prognostic role of the cancer stem cell marker CD44 in ovarian cancer: a meta-analysis. Cancer Cell Int. 2017 Jan 5; 17:8. https://doi.org/10.1186/s12935–016–0376–4Lin J, Ding D. The prognostic role of the cancer stem cell marker CD44 in ovarian cancer: a meta-analysis. Cancer Cell Int. 2017 Jan 5; 17:8. https://doi.org/10.1186/s12935–016–0376–4Morath I, Hartmann TN, Orian-Rousseau V. CD44: More than a mere stem cell marker. Int J Biochem Cell Biol. 2016; 81(Pt A):166–173. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2016.09.009Morath I, Hartmann TN, Orian-Rousseau V. CD44: More than a mere stem cell marker. Int J Biochem Cell Biol. 2016; 81 (Pt A):166–173. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2016.09.009Basakran NS. CD44 as a potential diagnostic tumor marker. Saudi Med J. 2015 Mar; 36(3):273–9. https://doi. org/10.15537/smj.2015.3.9622Basakran NS. CD44 as a potential diagnostic tumor marker. Saudi Med J. 2015 Mar; 36(3):273–9. https://doi. org/10.15537/smj.2015.3.9622Morath I, Hartmann TN, Orian-Rousseau V. CD44: More than a mere stem cell marker. Int J Biochem Cell Biol. 2016; 81(Pt A):166–173. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2016.09.009Morath I, Hartmann TN, Orian-Rousseau V. CD44: More than a mere stem cell marker. Int J Biochem Cell Biol. 2016; 81(Pt A):166–173. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2016.09.009Lin J, Ding D. The prognostic role of the cancer stem cell marker CD44 in ovarian cancer: a meta-analysis. Cancer Cell Int. 2017; 17:8. https://doi.org/10.1186/s12935–016–0376–4Lin J, Ding D. The prognostic role of the cancer stem cell marker CD44 in ovarian cancer: a meta-analysis. Cancer Cell Int. 2017; 17:8. https://doi.org/10.1186/s12935–016–0376–4Бреус А.А., Франциянц Е.М., Кит О.И., Шевченко А.Н., Нескубина И.В., Дженкова Е.А. и др. Половые различия в содержании компонентов инсулиноподобного сигнального пути в тканях почки при локальном и генерализованном светлоклеточном раке почки. Современные проблемы науки и образования. 2019;(5):81.Breus AA, Frantsiyants EM, Kit OI, Shevchenko AN, Neskubina IV, Dzhenkova EA, et al. Sexual differences in the content of insulin-like signaling pathway components in kidney tissues in local and generalized clear cell kidney cancer. Modern Problems of Science and Education. 2019;(5):81. (In Russian).Нефедова Н.А., Давыдова С.Ю. Роль сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и гипоксия-индуцибельного фактора (HIF) в опухолевом ангиогенезе. Cовременные проблемы науки и образования. 2015;(3):51.Nefedova NA, Davydova SYu. He role of vascular endothelial growth factor and hipoxia-inducible factor in tumor`s angiogenesis. Modern Problems of Science and Education. 2015;(3):51. (In Russian).Гервальд В.Я., Сеченов Е.И., Черданцева Т.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Авдалян А.М. и др. Экспрессия маркера пролиферации Ki 67 при раке почки: клинико-морфологические сопоставления. Сибирский онкологический журнал. 2012;(S1):43–44.Gerval'd VYa., Sechenov EI., Cherdantseva TM., Bobrov IP., Klimachev VV., Avdalyan AM., et al. Expression of the Ki 67 proliferation marker for kidney cancer: clinical and morphological comparisons. Siberian journal of oncology. 2012;(S1):43–44. (In Russian).Li Z, Liu J, Zhang X, Fang L, Zhang C, Zhang Z, et al. Prognostic Significance of Cyclin D1 Expression in Renal Cell Carcinoma: a Systematic Review and Meta-analysis. Pathol Oncol Res. 2019 Nov 20. https://doi.org/10.1007/s12253–019–00776–0Li Z, Liu J, Zhang X, Fang L, Zhang C, Zhang Z, et al. Prognostic Significance of Cyclin D1 Expression in Renal Cell Carcinoma: a Systematic Review and Meta-analysis. Pathol Oncol Res. 2019 Nov 20. https://doi.org/10.1007/s12253–019–00776–0Pestell RG. New roles of cyclin D1. Am J Pathol. 2013 Jul; 183(1):3–9. https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2013.03.001Pestell RG. New roles of cyclin D1. Am J Pathol. 2013 Jul; 183(1):3–9. https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2013.03.001Morel A P, Hinkal GW, Thomas C, Fauvet F, Courtois-Cox S, Wierinckx A, et al. EMT inducers catalyze malignant transformation of mammary epithelial cells and drive tumorigenesis towards claudin-low tumors in transgenic mice. PLoS Genet. 2012; 8(5): e1002723. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002723Morel A P, Hinkal GW, Thomas C, Fauvet F, Courtois-Cox S, Wierinckx A, et al. EMT inducers catalyze malignant transformation of mammary epithelial cells and drive tumorigenesis towards claudin-low tumors in transgenic mice. PLoS Genet. 2012; 8(5): e1002723. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002723Roy SS, Gonugunta VK, Bandyopadhyay A, Rao MK, Goodall GJ, Sun L Z, et al. Significance of PELP1/HDAC2/miR 200 regulatory network in EMT and metastasis of breast cancer. Oncogene. 2014 Jul 10; 33(28):3707–3716. https://doi.org/10.1038/onc.2013.332Roy SS, Gonugunta VK, Bandyopadhyay A, Rao MK, Goodall GJ, Sun L Z, et al. Significance of PELP1/HDAC2/miR 200 regulatory network in EMT and metastasis of breast cancer. Oncogene. 2014 Jul 10; 33(28):3707–3716. https://doi.org/10.1038/onc.2013.332Ващенко Л.Н., Карнаухов Н.С., Гудцкова Т.Н., Кварчия М.В. Сопоставление уровня экспрессии маркеров пролиферации Ki 67 и циклина D1 в тройном негативном раке молочной железы с различным андрогеновым статусом. Современные проблемы науки и образования. 2018;(4):146.Vashchenko LN, Karnaukhov NS, Gudtskova TN, Kvarchiya MV. Comparison of the level of expression of markers of proliferation Ki 67 and cycline D1 in the tripl negative breast cancer with a different androgen status. Modern Problems of Science and Education. 2018;(4):146. (In Russian).Кузнецов М.Б., Колобов А.В. Исследование влияния антиангиогенной монотерапии на прогрессию гетерогенной опухоли с помощью методов математического моделирования. Компьютерные исследования имоделирование. 2017; 9(3):487– 501. https://doi.org/10.20537/2076–7633–2017–9-3–487–501Kuznetsov MB, Kolobov AV. Mathematical investigation of antiangiogenic monotherapy effect on heterogeneous tumor progression. Computer Research and Modeling. 2017; 9(3):487–501. (In Russian). https://doi.org/10.20537/2076–7633–2017–9-3– 487–501Скворцов В.А., Манихас Г.М. Циклин D1 и его прогностическая значимость в планировании эндокринной терапии у женщин постменопаузального возраста при раке молочной железы. Врач-аспирант. 2012; 50(1.3):401–406.Skvortsov VA, Manikhas GM. Cyclin D1 and it's prognostic value in planning of endocrine therapy of women of postmenopousal age with breast cancer. Postgraduate Doctor. 2012; 50(1.3):401– 406. (In Russian).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.