Рак характеризуется неконтролируемой скоростью пролиферации клеток даже при низкой доступности питательных веществ, что поддерживается метаболическим перепрограммированием, которое в настоящее время признано одним из ведущих признаков рака [1]. Митохондрии являются динамическими органеллами, участвующими в многочисленных физиологических функциях. Помимо своей функции в производстве аденозинтрифосфата (АТФ), митохондрии регулируют процесс гибели клеток, образование активных форм кислорода (АФК), участвуют в активации иммунитета и обмене веществ. Митохондрии также играют ключевую роль в буферизации цитозольного кальция, а кальций, транспортируемый в матрикс, регулирует метаболизм митохондрий. Недавно идентификация митохондриального кальциевого унипортера (MCU) и связанных с ним регуляторов позволила охарактеризовать новые физиологические роли кальция как в митохондриальном, так и в клеточном гомеостазе [2]. Отто Варбург был первым, кто установил связь между раком и митохондриями; однако он интерпретировал усиленный аэробный гликолиз как митохондриальную дисфункцию. Сегодня принято считать, что многие типы раковых клеток для поддержания своего гомеостаза нуждаются в полностью функциональных митохондриях. Кальций (Ca2+) – ключевой регулятор нескольких клеточных процессов – доказал свою важность для митохондриального метаболизма. Для поддержания митохондриальной функции и клеточного энергетического баланса необходим инозитол‑1,4,5‑трифосфатный рецептор (IP3R) – опосредованный перенос Ca2+ из эндоплазматического ретикулума в митохондрии через MCU. Как IP3R, так и MCU сверхэкспрессируются в нескольких типах раковых клеток, и ингибирование связи Ca2+ между этими двумя переносчиками вызывает остановку пролиферации, уменьшение миграции и гибель клеток через механизмы, которые не до конца понятны [1].

Накопление Ca2+ в митохондриальном матриксе имеет важные последствия для нескольких процессов, включая аутофагию, метаболизм и апоптоз [3][4]. Во многих типах клеток для поддержания многоклеточных ответов используется повсеместный сигнальный механизм Ca2+, представленный динамическим изменением концентрации свободного цитозольного Ca2+, что обычно называют «Ca2+ колебания». Эти внутриклеточные переходные и локальные повышения Ca2+ генерируются каналами его высвобождения, расположенными в эндоплазматическом ретикулуме (ER). Кальций может распространяться внутри клетки с помощью сложной сети высвобождающих Ca2+ эффекторов (таких как IP3, cADPR и NAADP), которые по отдельности или в комбинации управляют преобразованием локальных сигналов для достижения четко определенной пространственно-временной картины передачи сигналов [5]. В то время как колебания Ca2+ имеют решающее значение для стимулирования митохондриального метаболизма, постоянное увеличение митохондриального Ca2+ вызывает гибель клеток, например, через открытые поры перехода проницаемости митохондрий (mPTP) [3][4]. Другая важная находка касается белка GPX8, глутатионпероксидазы, в наружной митохондриальной мембране (MАM), где он избирательно регулирует накопление и поток Ca2+ через свой трансмембранный домен [6]. MAM также играет роль в митохондриальной биоэнергетике, митохондриальной морфологии и подвижности митохондрий, а непосредственная близость органелл регулирует механизм, ответственный за митохондриальную динамику [7]. Сообщалось, что митохондриальный белок – Miro‑1, который прикреплен к внутренней митохондриальной мембране (OMM) своим трансмембранным доменом и выступает в цитозоль,– взаимодействует с некоторыми белками и организует движение митохондрий вдоль микротрубочек в зависимости от уровня кальция [8].

Взаимодействие между ER и митохондриями при раке было описано во многих исследованиях, обсуждающих функцию онкогенов и онкосупрессоров в модуляции переноса Ca2+ и активных форм кислорода (ROS) в MAMs [9][10]. В частности, доклад Sassano et al. [11] обрисовывает в общих чертах роль MAMs в росте рака. Таким образом, МАМ и Ca2+ играют ключевую роль в клеточной адаптации и путях гибели клеток, влияя на функцию раковых клеток [12].

Цель исследования: изучить уровень кальция в митохондриях клеток различных органов при стандартном и стимулированном росте экспериментальной меланомы B16/F10.

Эксперимент выполнен на мышах-самках линии С57ВL/6 (n=168), 8‑недельного возраста с начальной массой 21–22 г. Животные были распределены методом случайной выборки на следующие экспериментальные группы: интактная группа (n=21), группа с воспроизведением модели хронической нейрогенной боли (ХНБ) (n=21), группа М меланома B16/F10 – мыши (n=63) со стандартной подкожной трансплантацией меланомы В16/F10, группа ХНБ+М – мыши (n=63), которым меланому В16/F10 трансплантировали через 3 недели после создания модели хронической нейрогенной боли. В исследовании были использованы животные, полученные из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» (филиал «Андреевка», Московская область). В работе использовали штамм мышиной меланомы В16/F10, полученный из ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н.Блохина» Минздрава России.

Работа с животными проводилась в соответствии с правилами «Европейской конвенции о защитеживотных, используемых в экспериментах» (Директива 86/609/ЕЕС), а также в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава России от 19.06.2003 г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики». Животные содержались при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Манипуляции с животными производили в боксе с соблюдением общепринятых правил асептики и антисептики. Комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России от 31.05.2018 г. был одобрен протокол исследования (протокол этического комитета № 2).

Трансплантация меланомы В16/F10 животным осуществлялась путем стандартного подкожного введения опухолевой взвеси под правую лопатку в объеме по 0,5 мл взвеси клеток в разведении 1:10 в физиологическом растворе. При стандартной трансплантации опухоль появляется в 100% случаев, достаточно быстро растёт и на 12–16 сутки роста метастазирует преимущественно гематогенно в легкие (60–90%), реже – в печень и селезенку.

Модель хронической нейрогенной боли (ХНБ) воспроизводили наложением лигатуры на седалищный нерв с двух сторон под ксила-золетиловым наркозом [13]. Наркоз: ксила-золетиловый, за 10 минут до основного наркоза; премедикация: ксилазин (препарат Ксила) внутримышечно, в дозе 0,05 мл/ кг массы тела (по инструкции), затем через 10 минут вводили Золетил‑50 в дозе 10 мг на 100 г массы.

Декапитацию животных производили на гильотине, в группе М и в группе М+ХНБ после трансплантации меланомы B16/F10 в сроки: 1‑я неделя – 7 день роста меланомы, 2‑я неделя – 14 день роста меланомы и 3‑я неделя – 21 день роста меланомы. Животных группы ХНБ выводили из эксперимента через 3 недели после воспроизведения модели ХНБ, одновременно декапитировались интактные животные. У животных после декапитации быстро иссекали кожу, опухоль, а также извлекали мозг, печень, почки и сердце. Условно здоровую кожу иссекали на максимально удаленном расстоянии от опухолевого узла. Митохондрии выделяли по методу Егоровой М.В., Афанасьева С.А. [14] (с применением хладагентов и дифференциального центрифугирования на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге Avanti J-E, BECMAN COULTER USA). Полученные митохондриальные образцы (концентрация белка 4–6 г/л) до анализа хранили при –80°С в среде выделения. Биохимическим методом определяли концентрацию кальция (Ca2+) с арсеназо III (Абрис+, Россия), белка – биуретовым методом (Ольвекс Диагностикум, Россия) на автоматическом анализаторе ChemWell (Awareness Technology INC, USA).

Статистический анализ результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0. Полученные данные подвергали анализу на соответствие распределения признаков нормальному закону распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка (для малых выборок). Сравнение количественных данных в группах (независимые выборки) проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса (множественные сравнения). Данные таблиц представлены в виде M±m, где M – среднее арифметическое значение, m – стандартная ошибка среднего, за уровень достоверности или статистической значимости принимали р≤0,05. При статистической обработке, полученных результатов соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.

Прежде всего, обращает внимание различное содержание кальция в митохондриях клеток исследуемых органов у интактных животных (табл. 1). Так минимальный уровень обнаружен в коже мышей, после этого следуют митохондрии сердца и мозга – в 19 раз и 26 раз выше относительно митохондрий кожи, затем почки – в 41 раз выше и печень – в 79 раз. Механизмы этих эффектов не ясны, хотя предположительно они должны зависеть от вида и возраста животного, а также от типа ткани.

Таблица 1. Динамика кальция в митохондриях органов при стандартном и стимулированном росте меланомы В16/F10 у самок линии С57ВL/6Table 1. The dynamics of calcium in organ mitochondria in standard and stimulated B16/F10 melanoma growth in C57BL/6 females

В качестве фактора, стимулирующего рост меланомы, выбрали воздействие хронической нейрогенной боли – ХНБ [13]. Установлено, что у самок мышей линии С57ВL/6 ХНБ вызывала разнонаправленные изменения уровня кальция в митохондриях изученных органов относительно митохондрий органов интактных животных: он снизился в мозге в 1,4 раза, в печени – в 2,6 раза, в сердце – в 3,2 раза, не изменился в почках и повысился в коже в 97 раз.

Далее изучили уровень кальция в митохондриях клеток указанных органов в динамике стандартного роста экспериментальной меланомы (М). Обнаружено, что в мозге животных на протяжении 1–2 недель уровень кальция превосходил контрольные значения в соответствующем органе в 3,1 раза, снижаясь в 2,1 раза через 3 недели, но оставаясь в 1,5 раза выше контрольных величин. В митохондриях клеток печени через 1 и 2 недели роста меланомы уровень кальция не имел статистически значимых отличий от показателя в соответствующем органе интактных животных, а через 3 недели снижался в 4,6 раза. В митохондриях клеток сердца уровень кальция через 1 неделю снизился в 2,7 раза относительно показателя в митохондриях сердца интактных мышей, через 2 недели – в 6,3 раза, через 3 недели – в 9,5 раза. В митохондриях клеток почек через 1 неделю роста меланомы уровень кальция был выше показателя в митохондриях почек интактных мышей в 1,9 раза, через 2 недели снизился относительно предыдущего срока исследования в 2,8 раза и был в 1,5 раза ниже контрольных величин, а через 3 недели снизился в 28 раз относительно предыдущего срока исследования и стал в 41 раз ниже контрольных показателей. В митохондриях клеток кожи, непораженной злокачественным процессом, уровень кальция через 1 неделю роста экспериментальной меланомы был в 84 раза выше показателя в митохондриях кожи интактных животных, через 2 недели показатель снизился в 1,9 раза относительно предыдущего срока и был в 45 раз выше контроля, а через 3 недели уровень кальция в митохондриях непораженной кожи был в пределах нормы. В ткани меланомы на протяжении всех трех недель ее роста уровень кальция вне зависимости от этапа исследования был выше контрольных величин в среднем в 60 раз.

Иная динамика уровня кальция в митохондриях клеток органов зарегистрирована у мышей с ростом меланомы на фоне ХНБ. Найдено, что в митохондриях мозга животных с меланомой на фоне ХНБ через 1 неделю уровень кальция возрос относительно соответствующих контрольных значений в 6,6 раза, снижаясь со 2‑й недели, и оставаясь в этот и последующий сроки в 19 раз ниже контрольных величин. В митохондриях клеток печени через 1 неделю не найдено статистически значимых изменений уровня кальция, а через 2 и 3 недели показатель резко снижался и оставался в 30 раз ниже значений в митохондриях печени у интактных мышей с ХНБ. В митохондриях клеток сердца уровень кальция через 1 неделю повысился в 5,5 раза относительно показателя в митохондриях сердца интактных мышей, через 2 и 3 недели снизился в 33 раза относительно предыдущего срока и оставался в 6 раз ниже контрольных величин. В митохондриях клеток почек животных с меланомой на фоне ХНБ через 1 неделю роста меланомы уровень кальция был выше показателя в митохондриях почек интактных мышей в 1,5 раза, через 2–3 недели снизился относительно предыдущего срока исследования в 65 раз, и был в 44 раза ниже контрольных величин. В митохондриях клеток кожи, непораженной злокачественным процессом, уровень кальция через 1 неделю роста экспериментальной меланомы на фоне ХНБ был в 5,7 раза ниже показателя в соответствующем контроле, снизившись через 2–3 недели в 17 раз относительно предыдущего срока и оставаясь в 97 раз ниже контроля. В ткани меланомы, растущей на фоне ХНБ, на протяжении всех трех недель ее роста уровень кальция вне зависимости от этапа исследования был ниже контрольных величин в коже с ХНБ в среднем в 57,1 раза.

Контроль митохондриальной концентрации Ca2+ имеет важное значение для функционирования клеток организма. Многие митохондриальные функции напрямую регулируются уровнем ионов Ca2+ внутри органелл. Существует концепция, в которой говорится о том, что его дисрегуляция имеет первостепенное значение в возникновении патологических состояний. Приток Ca2+ в митохондрии необходим для активации митохондрий и почти всегда свидетельствует о повышенном потреблении энергии в клетках [15].

Обнаруженное в настоящем исследовании различное содержание кальция в митохондриях органов интактных мышей свидетельствует об их различной потребности в энергии в физиологических условиях. ХНБ воздействует на организм мышей как возмущающий фактор, приводящий к изменению функциональной способности митохондрий ряда органов. Падение уровня кальция в мозге, печени и сердце свидетельствует о снижении активации митохондрий и уменьшении потребления энергии в этих клетках. Напротив, увеличение уровня кальция в митохондриях кожи указывает на то, что ХНБ вызвала активацию этих органелл и усиление энергетических процессов. ХНБ не оказала влияние на метаболизм кальция в почках. Выявленная дисфункция митохондрий согласуется и с гипотезой этиопатогенеза хронической нейрогенной боли [16].

Одна неделя стандартного развития меланомы привела к значимому повышению уровня кальция в митохондриях мозга, почек и кожи. В митохондриях мозга такая ситуация сохранялась и через 2 недели, снижение найдено только через 3 недели, но при этом уровень кальция все равно не достиг интактных значений. В митохондриях печени повышение уровня кальция происходит через 2 недели развития меланомы и отмечено падение ниже интактных значений через 3 недели. В митохондриях сердца, почек и кожи падение уровня кальция начинается со второй недели и через 3 недели определяются лишь его следы. Вместе с тем в митохондриях самой меланомы, начиная с первой недели и на протяжении всего срока исследования, отмечалась значительная его концентрация.

Другая динамика уровня кальция наблюдается в митохондриях органов при стимулированном ХНБ росте меланомы. Через 1 неделю ее развития уровень кальция в митохондриях мозга, сердца и почек резко возрос, это не коснулось митохондрий печени, а в органеллах кожи его уровень снизился относительно соответствующего контроля с ХНБ. Начиная со 2 недели роста меланомы уровень кальция в митохондриях всех исследованных органов, резко упал до следовых количеств. В ткани опухоли, растущей на фоне ХНБ, через 1 неделю уровень кальция был значительно ниже показателя в соответствующей интактной коже с ХНБ, начиная со второй недели его уровень упал во всех других исследуемых образцах до следовых значений.

В различных исследованиях диабета I типа у животных сообщалось, что как поглощение Ca2+ клетками и митохондриями, так и открытие поры МРТ (митохондриальная проницаемость переходной поры) либо стимулируются, либо подавляются [17][18]. Механизмы этих эффектов часто не ясны, хотя предположительно они должны зависеть от вида и возраста животного, а также от типа ткани.

Поглощение Ca2+ органеллами в первую очередь достигается за счет митохондриального унипортерного комплекса Ca2+ MCU, основным компонентом которого является порообразующий белок MCU. Переходные поры MCU представляют собой высокоселективный Ca2+ канал, который переносит Ca2+ через внутреннюю митохондриальную мембрану и связан с другими субъединицами, как структурными, так и регуляторными: MCUb, MICU1–2, EMRE и MCUR1 [19]. Предполагают, что изменения в митохондриальном транспорте Ca2+ происходят преимущественно на уровне поровых, а не регуляторных субъединиц унипортерного комплекса. Кроме того, структурно-функциональные изменения в унипортерном комплексе Ca2+, по-видимому, зависят от ткани.

Известно, что избыточное накопление Ca2+ в митохондриях способствует открытию Ca2+-зависимых митохондриальных пор, что является ключевым этапом в механизме запрограммированной гибели клеток. Митохондриальная проницаемость переходной поры (MPT pore) рассматривается как белковый мега канал, включающий в себя белки внутренней и внешней мембран митохондрий. Не совсем ясно, какие именно белки формируют пору, но в настоящее время считается, что они являются либо митохондриальной АТФ-синтазой, либо аденилатным транслокатором. Также установлено, что поры MPT включают циклофилин D, регуляторный белок, нацеленный на ингибитор пор циклоспорин А (CsA) [19][20].

Как уже упоминалось выше, избыточное накопление Ca2+ вмитохондриях приводит к открытию пор в мембране органелл [19]. В результате трансмембранные градиенты ионов и мембранный потенциал (Δmm) разрушаются, а митохондрии набухают, что приводит к разрыву их наружной мембраны и высвобождению проапоптических белков из органелл. Одним из факторов, способствующих открытию пор в митохондриях, является окислительный стресс [19]. Продукты перекисного окисления липидов могут изменять упаковку мембраны и увеличивать ее микровязкость. Образование липидных пор в мембране зависит от физико-химических свойств и структуры ее липидного бислоя. Было показано, что изменения липидного состава и микровязкости мембраны (индуцированные ненасыщенным кардиолипином или ненасыщенными свободными жирными кислотами) приводят к стимуляции образования липидных пор как в липосомах, так и в митохондриях [21]. Следует отметить, что, как и липидные поры, индуцированные пальмитатом/ Ca2+ поры имеют тенденцию самопроизвольно закрываться, что может привести к восстановлению Δmm. Восстановление Δmm было продемонстрировано в работе, в которой также предположили, что эти поры могут быть неспецифической системой для высвобождения Ca2+ из органелл [22]. Образование липидных пор можно рассматривать как экстренный вариант быстрого высвобождения Ca2+ из митохондрий, который, в отличие от CsA- и повреждению органелл.

Митохондрии сердца имеют низкий порог активации для транспорта Ca2+ и более низкую емкость Ca2+ по сравнению с печенью, что объясняется низким уровнем экспрессии MICU1 в сердце [23]. Кальций, высвобождаемый из саркоплазматического ретикулума (SR), особо ценен для связи возбуждения–сокращения (E–C) сердечной мышцы. Митохондрии, главный источник энергии, в виде АТФ, необходимых для сердечной сократимости, тесно связаны с SR, и Ca2+ имеет большое значение для оптимальной функции этих органелл. Однако накопление Ca2+ может ухудшать митохондриальную функцию, приводя к снижению выработки АТФ и увеличению высвобождения активных форм кислорода. Santulli G. et al. [24] впервые показали, что диастолическая утечка Ca2+ вызывает перегрузку митохондрий Ca2+ и дисфункцию в мышечной модели постмиокардиального инфаркта миокарда. Существуют две формы каналов высвобождения Ca2+ в сердечной мышце: рецепторы типа 1 ryanodine (RyR2s) и рецепторы типа 2 inositol 1,4,5‑trisphosphate (IP3R2s). Авторы обнаружили, что каналы RyR2 приводят к митохондриальной перегрузке Ca2+, дисморфологии и дисфункции. В отличие от этого, кардиоспецифическая блокировка IP3R2 не оказывала существенного влияния на адаптацию митохондрии к сердечной недостаточности. Кроме того, генетически обусловленное усиление антиоксидантной активности митохондрий улучшило митохондриальную функцию и уменьшило посттрансляционные модификации макромолекулярного комплекса RyR2. Эти данные показали, что комплекс RyR2, но не рецептор IP3R2, вызывает перегрузку митохондрий Ca2+ и их дисфункцию [24].

Очевидно, что рост экспериментальной меланомы B16/F10 у самок мышей сопровождается нарушением содержания кальция, что является проявлением митохондриальной дисфункции, затрагивающей большинство органов. Стимуляция роста экспериментальной меланомы посредством хронической нейрогенной боли, в отличие от стандартного варианта роста, вносит определенные изменения в накопление кальция в митохондриях клеток не только органов, но и непосредственно самой опухоли. Хронический болевой синдром, который сопровождает злокачественный процесс, способен влиять на его течение с вовлечением митохондрий и модификацией их функций.