Молекулярные аспекты воздействия вторичных метаболитов Барбариса обыкновенного и Белокопытника гибридного на клеточную линию HeLa

Цель исследования. Выделить и верифицировать чистые фракции вторичных метаболитов растений, содержащихся в B. vulgaris (L.) и P. hibridus (L.), а также провести модельный эксперимент и молекулярно-генетическое исследование для оценки их цитотоксического действия в условиях in vitro на клеточной линии HeLa.

Материалы и методы. Выделение и верификация всех использованных в эксперименте соединений проводили методами колоночной хроматографии и ядерно-магнитного резонанса на кафедре природных соединений химического факультета Южного федерального университета. Дальнейший эксперимент выполнен с использованием культуральных и молекулярных методов на клеточной линии HeLa в трех повторах для каждого исследуемого соединения, после инкубации с которыми проводили учет количества мертвых клеток на автоматическом счетчике NanoEnTek JuliFl, а также измерение количества клеток в состоянии апоптоза методом проточной цитофлюориметрии на анализаторе BD FACSCanto II. Оценку уровня копийности и экспрессии генов, ответственных за апоптоз, выполняли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (RT-PCR). Всего исследовали 3 вещества, по 2 концентрации (4 и 12 мкг/мл) и 2 экспозиции (24 и 72 часа) каждого из них.

Результаты. На первом этапе исследования были выделены и верифицированы алкалоид берберин, экстрагированный из корней B. vulgaris (L.), а также 2,4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one и 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-dicarbaldehyde из P. hibridus (L.). На следующем этапе исследования было обнаружено, что клеточная гибель была максимальной под действием берберина при экспозиции 72 часа. Однако оценка показателей копийности и экспрессии генов CASP8, CASP9, CASP3, BAX, BCL2, TP53 и MDM2 методом RT-PCR выявила наличие инициации апоптоза в опухолевых клетках на молекулярном уровне под действием всех исследованных соединений: как берберина, так и производных фурана и азулена, полученных из P. hibridus (L.).

Заключение. Все использованные в эксперименте соединения показали цитотоксическое действие на клеточную линию HeLa. Алкалоид берберин проявил наиболее выраженное цитотоксическое действие на линию HeLa зарегистрированное всеми используемыми в исследовании методами. Терпеноиды 4-dihydroxy-2,5-dimethylfuran-3(2H)-one и 2,2,8-trimethyldecahydroazulene-5,6-d icarbaldehyde при воздействии на линию HeLa вызвали увеличение показателей копийности и экспрессии локусов CASP9, CASP3 которые являются однимм из основных активаторов апоптоза. Они же оказали влияние на экспрессию локусов TP53 и MDM2.

1. Rosato I, Dalla Zuanna T, Tricarico V, Barbiellini Amidei C, Canova C. Adherence to cervical cancer screening programs in migrant populations: A systematic review and meta-analysis. Int J Environ Res Public Health. 2023;20(3):2200. https://doi.org/10.3390/ijerph20032200

2. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, Bray F. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209–249. https://doi.org/10.3322/caac.21660

3. Gado F, Ferrario G, Della Vedova L, Zoanni B, Altomare A, Carini M, et al. Targeting Nrf2 and NF-κB signaling pathways in cancer prevention: The role of apple phytochemicals. Molecules. 2023;28(3):1356. https://doi.org/10.3390/molecules28031356

4. Alves-Silva JM, Romane A, Efferth T, Salgueiro L. North African Medicinal Plants Traditionally Used in Cancer Therapy. Front Pharmacol. 2017 Jun 26;8:383. https://doi.org/10.3389/fphar.2017.00383

5. Yan Z, Lai Z, Lin J. Anticancer properties of traditional Chinese medicine. Comb Chem High Throughput Screen. 2017;20(5):423– 429. https://doi.org/10.2174/1386207320666170116141818

6. Habli Z, Toumieh G, Fatfat M, Rahal ON, Gali-Muhtasib H. Emerging cytotoxic alkaloids in the battle against cancer: Overview of molecular mechanisms. Molecules. 2017;22(2):250. https://doi.org/10.3390/molecules22020250

7. Hsiao YT, Kuo CL, Chueh FS, Liu KC, Bau DT, Chung JG. Curcuminoids induce reactive oxygen species and autophagy to enhance apoptosis in human oral cancer cells. Am J Chin Med. 2018;46(5):1145–1168. https://doi.org/10.1142/s0192415x1850060x

8. Bernardini S, Tiezzi A, Laghezza Masci V, Ovidi E. Natural products for human health: A historical overview of the drug discovery approaches. Nat Prod Res. 2018;32(16):1926–1950. https://doi.org/10.1080/14786419.2017.1356838

9. Kulinowski Ł, Luca SV, Minceva M, Skalicka-Woźniak K. A review on the ethnobotany, phytochemistry, pharmacology and toxicology of butterbur species (Petasites L.). J Ethnopharmacol. 2022;293:115263. https://doi.org/10.1016/j.jep.2022.115263

10. Guo L, Li K, Cui ZW, Kang JS, Son BG, Choi YW. S-Petasin isolated from Petasites japonicus exerts anti-adipogenic activity in the 3T3-L1 cell line by inhibiting PPAR-γ pathway signaling. Food Funct. 2019;10(7):4396–4406. https://doi.org/10.1039/c9fo00549h

11. Wang ZH, Hsu HW, Chou JC, Yu CH, Bau DT, Wang GJ, et al. Cytotoxic effect of s-petasin and iso-s-petasin on the proliferation of human prostate cancer cells. Anticancer Res. 2015;35(1):191–199.

12. Guo L, Kang JS, Kang NJ, Choi YW. S-petasin induces apoptosis and inhibits cell migration through activation of p53 pathway signaling in melanoma B16F10 cells and A375 cells. Arch Biochem Biophys. 2020;692:108519. https://doi.org/10.1016/j.abb.2020.108519

13. Matsumoto T, Imahori D, Saito Y, Zhang W, Ohta T, Yoshida T, et al. Cytotoxic activities of sesquiterpenoids from the aerial parts of Petasites japonicus against cancer stem cells. J Nat Med. 2020;74(4):689–701. https://doi.org/10.1007/s11418-020-01420-x

14. Lu B, Hu M, Liu K, Peng J. Cytotoxicity of berberine on human cervical carcinoma HeLa cells through mitochondria, death receptor and MAPK pathways, and in-silico drug-target prediction. Toxicol In Vitro. 2010;24(6):1482–1490. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2010.07.017

15. Zhu X, Yue H, Guo X, Yang J, Liu J, Liu J, Wang R, Zhu W. The Preconditioning of Berberine Suppresses Hydrogen Peroxide-Induced Premature Senescence via Regulation of Sirtuin 1. Oxid Med Cell Longev. 2017;2017:2391820. https://doi.org/10.1155/2017/2391820

16. Chuang TY, Wu HL, Min J, Diamond M, Azziz R, Chen YH. Berberine regulates the protein expression of multiple tumorigenesis-related genes in hepatocellular carcinoma cell lines. Cancer Cell Int. 2017 May 30;17:59. https://doi.org/10.1186/s12935-017-0429-3

17. Luo H, Vong CT, Chen H, Gao Y, Lyu P, Qiu L, et al. Naturally occurring anti-cancer compounds: shining from Chinese herbal medicine. Chin Med. 2019;14:48. https://doi.org/10.1186/s13020-019-0270-9

18. Li J, Liu F, Jiang S, Liu J, Chen X, Zhang S, Zhao H. Berberine hydrochloride inhibits cell proliferation and promotes apoptosis of nonsmall cell lung cancer via the suppression of the MMP2 and Bcl-2/Bax signaling pathways. Oncol Lett. 2018 May;15(5):7409–7414. https://doi.org/10.3892/ol.2018.8249

19. Zhong XD, Chen LJ, Xu XY, Liu YJ, Tao F, Zhu MH, et al. Berberine as a potential agent for breast cancer therapy. Front Oncol. 2022;12:993775. https://doi.org/10.3389/fonc.2022.993775

20. Yao Z, Wan Y, Li B, Zhai C, Yao F, Kang Y, Liu Q, Lin D. Berberine induces mitochondrial mediated apoptosis and protective autophagy in human malignant pleural mesothelioma NCI H2452 cells. Oncol Rep. 2018 Dec;40(6):3603–3610. https://doi.org/10.3892/or.2018.6757

21. Rossberg M, Lendle W, Pfleiderer G, Togel A, Dreher EL, Langer E, et al. Chlorinated Hydrocarbons. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. Weinheim: Wiley-VCH; 2006. https://doi.org/10.1002/14356007.a06_233

22. Кит О. И., Филиппова С. Ю., Тимофеева С. В., Ситковская А. О., Златник Е. Ю., Колпаков С. А., и др. Влияние онколитических штаммов новой неклассифицированной группы ротавирусов человека на лимфоциты периферической крови. ЮжноРоссийский онкологический журнал. 2021;2(3):23–30. https://doi.org/10.37748/2686-9039-2021-2-3-3

23. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987;162(1):156–159. https://doi.org/10.1006/abio.1987.9999

24. Кутилин Д. С., Зинькович М. С., Гусарева М. А., Фаенсон А. В., Карнаухова Е. А., Розенко Л. Я., и др. Копийность генов как фактор устойчивости опухолевых клеток предстательной железы к облучению. Современные проблемы науки и образования. 2020;4:82. https://doi.org/10.17513/spno.29866

25. Suzuki N, Johmura Y, Wang TW, Migita T, Wu W, Noguchi R, et al. TP53/p53-FBXO22-TFEB controls basal autophagy to govern hormesis. Autophagy. 2021;17(11):3776–3793. https://doi.org/10.1080/15548627.2021.1897961

26. Warowicka A, Nawrot R, Goździcka-Józefiak A. Antiviral activity of berberine. Arch Virol. 2020;165(9):1935–1945. https://doi.org/10.1007/s00705-020-04706-3

27. Zhang C, Sheng J, Li G, Zhao L, Wang Y, Yang W, et al. Effects of berberine and its derivatives on cancer: A systems pharmacology review. Front Pharmacol. 2020;10:1461. https://doi.org/10.3389/fphar.2019.01461

28. Liu D, Meng X, Wu D, Qiu Z, Luo H. A natural isoquinoline alkaloid with antitumor activity: Studies of the biological activities of berberine. Front Pharmacol. 2019;10:9. https://doi.org/10.3389/fphar.2019.00009

29. Suyatmi S, Mudigdo A, Purwanto B, Indarto D, Hakim FA, Krisnawati DI. Brazilin isolated from caesalpina sappan wood induces intrinsic apoptosis on A549 cancer cell line by increasing p53, caspase-9, and caspase-3. Asian Pac J Cancer Prev. 2022;23(4):1337– 1343. https://doi.org/10.31557/apjcp.2022.23.4.1337

30. Levine AJ. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nat Rev Cancer. 2020;20(8):471–480. https://doi.org/10.1038/s41568-020-0262-1